無乳鏈球菌探針法熒光定量PCR試劑盒檢測使用方法：

一、稀釋PCR陽性對照（以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）

1. 注意：由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的DNA片段作為陽性對照。

2. 標記6個離心管，分別為7，6，5，4，3，2。

3. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。

4. 在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。

5. 換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。

6. 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽性對照到5號管中，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。

7. 重復上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。

二、樣品DNA的制備

8. 如果有N個樣品，必須設置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）。可以用10μL上步制備的PCR陽性對照的第4號（濃度為1×10E4 拷貝/μL，10μL相當于1萬拷貝）或第5號（濃度為1×10E5 拷貝/μL，10μL相當于10萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品，則PC和NC的體積也必須是200μL。

9. 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數病毒DNA提取試劑盒兼容。

三、設置qPCR反應（20 μL體系，在樣品制備室進行）

10. 如果只做1次重復，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照，6個用于PCR陽性對照。如果做2-3次重復，則反應設置數量相應增加2或3倍。

11. 產品僅用于科研在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后加）

內分泌腺來源血管內皮生長因子(EG-VEGF)重組蛋白
內凝集蛋白1(ITLN1)重組蛋白
內皮素1(EDN1)重組蛋白
內皮素轉化酶1(ECE1)重組蛋白
內皮糖蛋白(ENG)重組蛋白
內皮細胞TEK酪氨酸激酶(Tie2)重組蛋白
內皮型一氧化氮合酶(NOS3)重組蛋白
內皮脂肪酶(LIPG)重組蛋白
內臟脂肪特異性絲氨酸蛋白酶抑制因子(Vaspin)重組蛋白
內脂素(VF)重組蛋白
鈉/鉀離子轉運ATP酶β3肽(ATP1β3)重組蛋白
腦紅蛋白(NGB)重組蛋白
腦型脂肪酸結合蛋白(FABP7)重組蛋白
腦源性神經營養因子(BDNF)重組蛋白
尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1(NOX1)重組蛋白
黏病毒耐藥蛋白1(MX1)重組蛋白
尿激酶型纖溶酶原激活因子(uPA)重組蛋白
尿激酶型纖溶酶原激活因子受體(uPAR)重組蛋白
尿皮質素1(UCN1)重組蛋白
凝溶膠蛋白(GS)重組蛋白
凝血因子Ⅱ(F2)重組蛋白
凝血因子Ⅴ(F5)重組蛋白